Alexis St-Gelais, chimiste – Vulgarisation
L’une des analyses les plus renommées de PhytoChemia au Canada est notre analyse détaillée des terpènes du cannabis. Ce test peut avoir différentes utilités et se présente sous deux déclinaisons, les terpènes « principaux » et les terpènes « complets» (main/full terpenes). Suivez ce guide sur les tenants et aboutissants de notre service d’analyse, et sur la manière dont il peut être utile à votre entreprise.
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En un coup d’oeil
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Dans ce billet, nous discuterons des grandes lignes et principes de notre approche, définirons les concepts de terpènes principaux/totaux et des résultats bruts/anhydres, et vous mettrons en garde contre les pièges associés au concept de « terpènes totaux ».
Les terpènes (et autres volatils) dans le cannabis et le chanvre
Outre les cannabinoïdes dont les présentations ne sont plus à faire, l’espèce Cannabis sativa est également une plante aromatique. Les trichomes des inflorescences, en particulier, ne sécrètent pas uniquement des cannabinoïdes mais aussi des molécules plus petites et volatiles, la plupart de celles-ci étant des terpènes. Le terme terpène désigne tous les composés partageant une origine commune au sein du métabolisme de la plante, dérivant d’assemblages d’unités d’isoprène. En plus de ces terpènes, quelques autres composés non-terpéniques mais néanmoins volatils sont également observées, comme l’hexanoate d’hexyle, qui est un ester d’acide gras.
Les terpènes sont loin d’être restreints au cannabis et au chanvre, et de plus, tous les terpènes ne sont pas des composés volatils. Par exemple, le lycopène qui confère à la tomate sa couleur rouge est un terpène et n’est pas volatil. Il est donc important de garder en tête que le terme « terpènes » est employé dans le domaine du cannabis comme raccourci linguistique pour désigner ses constituants volatils, mais que le recouvrement entre ces deux catégories n’est pas parfait. Dans ce billet, nous utiliserons la signification la plus usuelle du terme terpènes* dans le secteur du cannabis, soit les composés volatils (avec un point d’ébullition inférieur au phytol) rencontrés dans la plante et comprenant principalement des terpènes.
Les terpènes du cannabis sont plutôt abondants. Pour des inflorescences séchées, les concentrations typiques peuvent aller d’aussi bas que 2-3 mg/g jusqu’à un peu plus de 60 mg/g, selon les variétés. Il n’est donc pas étonnant que cette richesse de composés attire l’attention en ce qui a trait au contrôle de la qualité, au développement de variétés et à la recherche de la meilleure souche à cultiver (phenohunting).
Comment nous analysons les terpènes du cannabis
Extraire les terpènes
De manière générale, les terpènes ont une bonne affinité pour les solvants organiques peu polaires, comme le dichlorométhane, l’hexane et le pentane. PhytoChemia utilise le pentane comme solvant d’extraction, puisqu’il peut être acheté en haute pureté compatible avec les analyses de chromatographie en phase gazeuse (voir ci-bas). On peut donc extraire les terpènes assez simplement en broyant le cannabis aussi finement que possible. Une quantité connue de plante broyée est mélangée à du pentane. À ce stade, une quantité connue d’octanoate de méthyle est ajoutée au contenant d’extraction – nous y reviendrons plus bas. Le tube est alors scellé et soumis à une agitation vigoureuse pour plusieurs minutes. Enfin, le solvant peut être soutiré et filtré pour obtenir un extrait liquide de terpènes, prêt pour analyse.
Comparaison des approches d’analyse
À titre de molécules volatiles, les terpènes du cannabis sont d’excellents candidats pour les analyses par chromatographie en phase gazeuse (GC). La GC réfère à la technique de séparation utilisée pour discriminer les terpènes les uns des autres afin de les identifier et quantifier. Une présentation générale de la GC peut être consultée ici.
Il est courant de mesurer les terpènes en dosant une série prédéterminée de molécules à partir de courbes d’étalonnage propres à chacune. Bien que valide sur la base de composés individuels, cette approche a le désavantage de ne fournir de l’information que pour les molécules ciblées et d’ignorer toutes les autres. Un grand nombre de terpènes présents dans le cannabis ne sont pas offerts commercialement pour établir la calibration et sont donc incompatibles avec cette technique. Autrement dit, avec ce dosage ciblé classique, il y a de bonnes chances pour que vous vous priviez d’une bonne partie du portrait d’ensemble.
Ce problème n’est pas exclusif au cannabis. Il est aussi très pertinent pour les industries des huiles essentielles et des fragrances, où le dosage individuel des molécules dans des mélanges complexes est soit impossible, par indisponibilité des substances pures, ou prohibitif en termes de temps et de main-d’œuvre requise. Pour contourner le problème, un groupe d’experts de la International organization of the Flavor Industry (IOFI) a travaillé pendant des années pour définir une approche robuste pour quantifier virtuellement n’importe quel composé volatil à partir d’une molécule de référence unique. Le résultat de ses travaux est paru en 2016 [1], et notre laboratoire est vite devenu un utilisateur convaincu de cette approche. Tous nos rapports réfèrent à l’article en question. Voyons voir comment il fonctionne en théorie.
La chromatographie en phase gazeuse couplée à la détection à ionisation de flamme (GC-FID)
L’approche de l’IOFI repose sur la chromatographie en phase gazeuse couplée à un détecteur à ionisation de flamme (GC-FID). Aussi bien avec la spectrométrie de masse (MS) qu’avec le FID, la sensibilité du détecteur à une molécule est dépendante de la structure de celle-ci. Toutefois, le FID est notoirement plus homogène à cet égard, tant d’une molécule à l’autre que d’un laboratoire à l’autre. Vous pouvez en apprendre plus à ce sujet dans un de nos billets précédents. Le détecteur de type FID fonctionne à partir de la combustion du carbone dans la flamme, où il est oxydé et génère des particules chargées qui permettent à un courant électrique de circuler dans la flamme. Plus il y a de carbone oxydé, plus il y a de particules chargées, et plus la conductivité électrique de la flamme augmente. Ainsi, le courant électrique circulant dans la flamme est corrélé à la quantité de molécules contenant du carbone qui sont brûlées à un moment donné pendant l’analyse.
Bien des molécules volatiles sont constituées non seulement de carbone, mais également d’autres types d’atomes. Ces atomes peuvent influencer le processus d’oxydation du carbone dans la flamme, ne serait que parce que, par exemple, de l’oxygène serait déjà lié à certains des atomes de carbone. Conséquemment, l’intensité du signal obtenu dans un détecteur de type FID pour deux molécules brûlées dans les mêmes quantités (masse) peut différer quelque peu. C’est la raison pour laquelle, formellement, chaque molécule devrait être individuellement dosée à partir de sa propre courbe d’étalonnage. C’est là où l’IOFI a proposé une alternative brillante.
Les facteurs de réponse prédits de l’IOFI
Cachet et al ont injecté près de 500 molécules volatiles individuelles sur des instruments GC-FID à diverses concentrations. En étudiant l’intensité de leur réponse au détecteur de type FID en fonction de leur concentration, ils ont remarqué qu’elle dépendait de la formule chimique du composé (nombre d’atomes de carbone, hydrogène, azote, soufre, fluor, chlore, brome, iode et silicium), son nombre de cycles benzènes, et sa masse moléculaire. Ainsi, lorsque la structure est connue, il devient théoriquement possible de prédire le comportement de réponse au détecteur d’une molécule, même lorsqu’on ne peut pas se procurer celle-ci pour établir une courbe d’étalonnage.
Afin de tirer parti de cette propriété de la réponse FID des molécules, le groupe de travail de l’IOFI utilise un standard interne d’octanoate de méthyle. Cette substance n’est pas présente naturellement dans le cannabis, et se prête ainsi bien à cet usage. L’octanoate de méthyle peut être ajouté en quantité connue dans un échantillon, et son signal est repéré sur le chromatogramme GC-FID au cours de l’analyse. Ce pic d’octanoate de méthyle dont l’intensité (c’est-à-dire l’aire sous la courbe) est connue peut être directement corrélé à la masse du standard dans l’échantillon injecté.
Tous les autres pics observés dans l’échantillon pourraient ensuite être quantifiés par comparaison avec ce pic de référence. Tel qu’expliqué plus haut, cela serait à première vue inapproprié puisque les molécules ne produiront pas toutes un signal avec la même relation concentration-réponse que l’octanoate de méthyle au détecteur FID. Un facteur de réponse prédit est donc appliqué au résultat brut pour corriger ce biais, sur la base d’une formule mathématique proposée par l’IOFI. Cette formule permet de rectifier le résultat pour un pic donné, d’abord quantifié en équivalents d’octanoate de méthyle, pour l’exprimer selon une concentration tenant compte de la formule chimique, de la masse moléculaire et du nombre de cycles benzènes de la molécule à l’étude. Avec cette approche, n’importe quel composé volatil peut être quantifié à partir de la référence d’octanoate de méthyle avec une erreur de calcul raisonnablement petite. PhytoChemia a eu recours à l’approche de l’IOFI pour participer à plusieurs essais interlaboratoire d’analyse de terpènes dans le cannabis, et les résultats ont toujours été conformes aux valeurs attendues, ce qui illustre l’élégance de cette technique. La méthodologie a été validée et notre rapport de validation peut être fourni sur demande à nos clients.
Identifier les pics
À ce stade, il est nécessaire de connaître l’identité et la structure des molécules générant les pics dans l’analyse, afin de pouvoir calculer le facteur de réponse prédit pour chaque molécule. Puisque nous ne sommes pas limités aux seuls terpènes disponibles commercialement comme références individuelles, nous pouvons élargir l’horizon de notre analyse et plutôt procéder à une interprétation chromatographique non-ciblée. Nous examinons ainsi chaque pic du chromatogramme à la recherche d’une correspondance. À cette fin, nous utilisons une combinaison de deux techniques: des indices de rétention sur deux colonnes, et des analyses complémentaires de spectrométrie de masse (GC-MS) lorsque nécessaire. Vous pouvez en découvrir plus sur ce processus dans ce billet présentant un exemple.
Tout au long de ce processus, et inévitablement dans le domaine de la phytochimie (la chimie des plantes), certaines molécules demeureront non-identifiées. Cela ne rend pas leur suivi inutile, mais implique seulement que la structure et le nom du composé ne sont pas connus. Les composés inconnus notables peuvent être mentionnés dans une analyse, aussi bien à titre de référence ultérieure que pour faire leur suivi tout comme on effectuerait le suivi de n’importe quel composé connu dans une démarche de contrôle de la qualité de lot en lot. Puisque l’IOFI se base sur des formules chimiques de composés connus pour calculer les facteurs de réponse prédits, la concentration des molécules inconnues est exprimée directement en équivalents d’octanoate de méthyle, sans application d’un facteur de correction.
En résumé
En combinant une extraction au pentane, un standard interne, l’approche de l’IOFI et l’interprétation méticuleuse des données obtenues en GC-FID avec des indices de rétention et des comparaisons avec des analyses complémentaires de GC-MS, PhytoChemia peut parvenir à fournir un criblage large et non-ciblé des terpènes dans un échantillon de cannabis ou de chanvre. Cela signifie que nous pouvons lister et quantifier tous les terpènes (et autres volatils) présents en quantités détectables suivant une procédure efficace, plutôt que d’être limités aux seules substances disponibles comme standards de calibration commerciaux. Avec notre analyse, vous obtenez le portrait d’ensemble!
L’analyse de terpènes en pratique (et la réponse à des questions récurrentes!)
« Terpènes complets » vs « Terpènes principaux »
PhytoChemia offre ses services de criblage de terpènes en deux déclinaisons: les terpènes complets et les terpènes principaux. Il est impératif de garder en tête que peu importe l’option retenue, l’approche analytique que nous appliquons est identique: même extraction, même standard interne, même instrumentation.
La différence entre ces deux services n’est pas basée sur des considérations scientifiques, mais plutôt pratiques. En effet, un facteur limitant notable de l’analyse de terpènes est l’interprétation des données, qui demande du temps – et tous les cas de figurent ne demandent pas nécessairement le même niveau de détail dans l’analyse. Les terpènes complets et principaux sont ainsi les deux faces d’une même pièce, adaptées par PhytoChemia pour répondre à différents besoins.
Le concept de terpènes complets signifie simplement que nous tenterons de répertorier autant de pics que raisonnablement faisable sur le chromatogramme. Cela produira une liste qui peut typiquement comprendre jusqu’à 150 à 180 molécules, bien que cela puisse être moins – cela dépend de la nature de l’échantillon lui-même et de ce qu’il donne à l’injection. Plusieurs des composés rapportés le seront en très faibles concentrations, et certains inconnus feront partie de la liste à titre de signaux récurrents dans l’espèce. Nous incluront en outre habituellement une courte phrase de conclusion résumant les caractéristiques saillantes du profil de terpènes lors de nos analyses de terpènes complets. Comme l’interprétation des résultats demande plus de temps de travail à notre équipe, faisant de ce service une variante haut de gamme, elle est offerte à un coût plus élevé.
Les terpènes principaux sont une liste d’un peu plus de 80 molécules volatiles (surtout des terpènes) qui a été choisie par PhytoChemia. Ce choix a été guidé parce que les substances listées répondaient à l’un des critères suivants:
- ∙ Elles sont régulièrement quantitativement importantes (comme le myrcène, le caryophyllène, ou le sélina-3,7(11)-diène);
- ∙ Elles sont caractéristiques du cannabis (comme les hydrates de pinène et l’ipsdiénol, ainsi que deux composés inconnus récurrents);
- ∙ Elles présentent une distribution de type présence/absence d’une variété à l’autre, ce qui permet de différencier les souches (comme le butyrate d’hexyle, le bulnésol ou le delta-guaiène, ainsi qu’un troisième composé inconnu fortement associé au terpinolène);
- ∙ Elles attiraient particulièrement l’attention de certains clients pour différentes raisons (comme le hashishène ou le phytol).
Puisque l’analyse des constituants mineurs n’est pas aussi détaillée, ce service d’entrée de gamme exige moins de temps d’interprétation des données et peut ainsi être offert à un coût inférieur.
Il est également pertinent de souligner que tous les terpènes principaux** sont inclus dans le criblage des terpènes complets. Enfin, gardez en tête que sans égard à l’option choisie, si votre échantillon est pauvre en terpènes et ne produit que peu de pics, le nombre de composés identifiés peut être plus faible dans les deux cas.
Guide rapide pour choisir les terpènes principaux ou complets:
- ∙ Si votre budget est limité, optez pour les terpènes principaux. Ils demandent moins d’analyse de données et sont offerts à moindre coût.
- ∙ Si vous avez besoin d’un niveau élevé de détail, choisissez les terpènes complets. Ils sont appropriés aux fins de recherche ou de pheno-hunting.
- ∙ Si vous produisez un extrait, comme du hash ou de la wax, allez vers les terpènes complets. Votre protocole d’extraction pourrait entraîner des résultats particuliers qui sont plus susceptibles d’être mis en lumière par ce criblage plus détaillé.
Le concept de terpènes totaux: utilisez avec précaution
Le contenu en terpènes totaux est une mesure qui devrait être employée avec la plus grande prudence, en raison de sa nature même: il s’agit de la somme de ce à quoi s’attarde un laboratoire particulier! Si l’un d’eux n’analyse que 10 terpènes, alors les terpènes totaux ne seront que la somme de ces 10 composés et ne tiendront pas compte de tout autre terpène qui pourrait être présent. Il est ainsi malheureusement très facile de se retrouver en train de comparer des valeurs qui sont complètement différentes mais qui sont regroupées sous le même concept.
Puisque PhytoChemia couvre un nombre plutôt élevé de terpènes comparativement à la plupart des laboratoires, il tombe également sous le sens que les totaux que nous rapportons soient plus élevés – ne serait-ce, par exemple, que parce que nous considérons tous les sesquiterpènes du groupe des sélinadiènes, le plus souvent abondants mais ignorés par les méthodologies « traditionnelles » de dosage de terpènes ciblés individuellement. Même si vous comparez des rapports tous issus de notre laboratoire mais préparé pour plusieurs clients, restez vigilants: ceux qui optent pour l’option des terpènes principaux obtiendront un certificat d’analyse comprenant typiquement environ 80 terpènes, qui représenteront ensemble environ 90 à 95% de ce qu’un criblage des terpènes complets aurait produit. Il s’agit d’une différence modeste, mais elle devrait être gardée en tête lorsque vient le temps de faire des comparaisons.
Ainsi, la comparaison entre nos rapports devrait être fiable, pour autant que vous ne compariez pas sans précautions les rapports de terpènes principaux et complets. Si vous souhaitez procéder à une telle comparaison, nous recommandons de d’abord trier les résultats des terpènes complets pour n’en retenir que les molécules présentes également dans les rapports de terpènes principaux et d’exclure toutes les autres. La comparaison croisée avec des résultats provenant d’autres laboratoires est susceptible d’entraîner du bruit dans les données et des incohérences, puisque les listes de terpènes suivis ne correspondront pas.
Un dernier paramètre à prendre en compte est la teneur en humidité résiduelle – référez-vous à la prochaine section sur les concentrations de terpènes brutes ou anhydres dans la prochaine section.
Donc, pour être pertinente, une valeur de « terpènes totaux » devrait idéalement être accompagnée d’une définition de ce qu’elle inclut.
Quant aux valeurs typiques de terpènes totaux (obtenues via nos tests), la majorité des échantillons qui nous sont soumis se trouvent dans une fourchette allant de 18 à 60 mg/g. Des teneurs sous les 10 mg/g sont plus caractéristiques du chanvre industriel, et qui n’a donc pas été sélectionné au fil du temps pour sa production de métabolites secondaires, alors que ce genre de concentration n’est pas courant pour le cannabis (du moins selon notre expérience). Nous avons observé des valeurs au-delà de 60 m/g dans quelques cas plus rares. Les extraits peuvent pour leur part atteindre des teneurs bien plus élevées, en fonction de leur nature, puisqu’ils peuvent avoir été produits de sorte à concentrer les terpènes. Une huile essentielle de cannabis ou de chanvre présentant des teneurs négligeables de cannabinoïdes s’approcherait d’une teneur en terpènes de 1000 mg/g, soit 100%.
Teneurs « anhydres » et « brutes » de terpènes
Lorsque l’on a affaire à du matériel végétal, la question de sa teneur en eau ou de son humidité résiduelle n’est jamais bien loin. Très souvent, les monographies des pharmacopées qui établissent une teneur réglementée de molécules caractéristiques dans les plantes médicinales le font sur une base sèche (anhydre). Cela signifie que la concentration, par exemple de curcumine dans le curcuma, devrait être rapportée par unité de masse de curcuma après avoir corrigé cette dernière pour sa teneur résiduelle en eau. Ainsi, 1 g de poudre de curcuma contenant 10% d’humidité résiduelle représente en fait 0.9 g de curcuma anhydre. Cette notion améliore la répétabilité interlaboratoire, puisque la teneur en humidité résiduelle peut varier en fonction des conditions locales. Pour un même échantillon d’origine de curcuma, si un laboratoire A le stocke dans une chambre froide à haute teneur en humidité, alors qu’un laboratoire B le range plutôt dans un contenant séché à l’aide d’un absorbeur d’humidité à base de silice, après quelques jours, l’humidité résiduelle va différer. La correction pour la teneur en eau retire cette source d’erreur.
D’un autre côté, pour les cannabinoïdes, Santé Canada priorise l’expression des résultats sur la base de l’échantillon tel que reçu (« brut »). Les concentrations sont ainsi exprimées par rapport à la masse de matière végétale pesée exactement telle qu’elle a été reçue au laboratoire, sans correction pour l’humidité. Cela dit, Santé Canada n’exige pas d’analyse de terpènes et ne fournit aucune indication à leur sujet, ce qui laisse la question sans réponse réglementaire. Devant la différence entre l’approche usuelle des pharmacopées et l’orientation de Santé Canada pour les cannabinoïdes, et puisque nos clients n’ont pas tous la même appréciation de la situation, PhytoChemia a choisi de rapporter les deux teneurs – sur une base anhydre et sur une base brute. Il est donc de la responsabilité de l’utilisateur final du rapport de sélectionner la valeur appropriée suivant ses propres spécifications. En outre, à des fins de comparaisons, on ne devrait jamais metre en parallèle des valeurs anhydres et brutes, puisqu’il s’agit de deux échelles de mesure distinctes.
Les concentrations anhydres sont toujours plus élevées. Elles offrent la possibilité de comparer les différentes variétés, même si leur teneur en humidité résiduelle peut varier. D’un autre côté, les concentrations brutes sont plus faibles (puisque la teneur en eau « dilue » les terpènes au sein de la masse de matière végétale totale) et permettent au consommateur d’évaluer plus précisément combien de terpènes se retrouvent dans une portion donnée de leur produit, puisque le cannabis n’est pas dans les faits utilisés sous une forme anhydre.
Pour les extraits et les produits transformés, pareille distinction n’est pas pertinente. La matière végétale n’atteint jamais une teneur d’humidité de 0% à moins d’être placée dans un four ou sous vide (ce qui ne convient généralement pas aux producteurs de cannabis), mais des extraits peuvent être entièrement séchés. Ainsi, la teneur en humidité n’est pas une question pertinente dans ces cas et les concentrations de terpènes sont alors rapportées comme une seule et unique valeur.
Notes
*Il est usuel de parler de terpènes du cannabis, par convention. Cela étant dit, si vous utilisiez une distillation à la vapeur sur du cannabis comme vous le feriez, par exemple, pour de la menthe poivrée, vous seriez en mesure de condenser un liquide organique et aromatique qui contiendrait les composés volatils (principalement de nature terpénique). Un tel liquide serait appelé une huile essentielle, et ce terme est celui qui est usuellement utilisé pour toutes les autres plantes aromatiques hormis le cannabis.
**La liste de terpènes inclus dans notre service de terpènes principaux est la suivante: hexanol, hashishène, α-thujène, α-pinène, camphène, α-fenchène, β-pinène, sabinène, myrcène, α-phellandrène, Δ3-carène, α-terpinène, para-cymène, limonène, β-phellandrène, 1,8-cinéole, (Z)-β-ocimène, (E)-β-ocimène, γ-terpinène, hydrate de cis-sabinène, octanol, fenchone, terpinolène, para-cyménène, hydrate de trans-sabinène, linalol, endo-fenchol, hydrate de trans-pinène, hydrate de cis-pinène, hydrate de camphène, époxyterpinolène, ipsdiénol, bornéol, terpinén-4-ol, para-cymén-8-ol, α-terpinéol, butyrate d’hexyle, citronellol, (4Z)-décénol, géraniol, décanol, α-cubébène, α-ylangène, hexanoate d’hexyle, β-caryophyllène, α-santalène, γ-élémène, α-guaiène, trans-α-bergamotène, α-humulène, allo-aromadendrène, (E)-β-farnésène, β-sélinène, valencène, α-selinène, δ-guaiène, β-bisabolène, (3E,6E)-α-farnésène, spirovétiva-1(10),7(11)-diène, érémophila-1(10),7(11)-diène, sélina-4(15),7(11)-diène, sélina-4,7(11)-diène, sélina-3,7(11)-diène, (E)-α-bisabolène, germacrène B, eudesma-5,7(11)-diène, (E)-nérolidol, oxyde de caryophyllène, guaiol, époxyde d’humulène II, 10-épi-γ-eudésmol, sélin-6-én-4α-ol et un isomère de celui-ci, γ-eudésmol, β-eudésmol, α-eudésmol, bulnésol, (3Z)-caryophylla-3,8(13)-dién-5β-ol, α-bisabolol, juniper camphor (camphre genévrier), aromadendra-4,10-diol, (2E,6E)-farnésol, cryptoméridiol, méta-camphorène et phytol, ainsi que jusqu’à trois composés inconnus caractéristiques du cannabis (deux sesquiterpènes et un monoterpène oxygéné).
