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Alexis St-Gelais – Vulgarisation

Je vous ai parlé il y a quelques temps des indices de rétention en GC-FID et de l’utilité d’avoir recours à deux colonnes pour analyser une huile essentielle. Comme c’est un aspect central du travail que nous réalisons en GC, j’ai pensé vous présenter aujourd’hui un cas concret d’analyse, qui vous permettra de mieux comprendre notre méthodologie. Tout au long de la discussion (comme dans nos rapports), l’abbréviation IR désignera les indices de rétention.

Nous nous pencherons sur un échantillon issu de la racine d’Anthriscus sylvestris (L.) Hoffm., communément appelé cerfeuil sauvage. Voyons d’abord le profil chromatographique à la figure 1.

Figure 1. Chromatogrammes de l'huile essentielle de racine de cerfeuil sauvage, sur colonne DB-5 (en haut) et Solgel-Wax (en bas).

Figure 1. Chromatogrammes de l’huile essentielle de racine de cerfeuil sauvage, sur colonne DB-5 (en haut) et Solgel-Wax (en bas).

L’observation des chromatogrammes nous donne déjà quelques informations. Avec l’expérience, on reconnaît les fenêtres de temps correspondant aux différentes familles chimiques des huiles essentielles. Ici, l’huile contient surtout des monoterpènes non oxygénés (qui sont élués tôt), et un monoterpène oxygéné important. Les sesquiterpènes y sont peu abondants, et je les ai exclus de la figure. Des ces chromatogrammes, nous extrayons ensuite des tableaux de données, dont le tableau 1 présente un extrait.

 Tableau 1. Exemple de données brutes extraites des chromatogrammes

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TR désigne le temps de rétention du pic. La colonne Aire indique l’aire sous la courbe associée au pic, et la colonne % indique le pourcentage de l’aire sous la courbe totale qu’on peut attribuer à ce pic. À ce stade, on n’a ni IR, ni identification.

Peu de temps avant avoir analysé cette huile essentielle, en juillet 2013, nous avions également injecté notre mélange standard d’alcanes, ce qui nous permet de calculer les IR des pics. Prenons l’exemple du pic élué à 35,86 minutes sur la colonne DB-5. Les deux alcanes les plus rapprochés sont le dodécane (12 carbones) à 30,05 minutes et le tétradécane (14 carbones) à 42,96 minutes. La formule que nous utilisons pour réaliser le calcul figure en bas de ce billet*. Nous utilisons un outil de calcul pour nous simplifier la tâche, et nous pouvons trouver que le pic à 35,86 minutes a un IR de 1290. C’est une valeur logique puisque, comme je l’ai expliqué dans un billet précédent, on assigne un IR de 1200 au dodécane et de 1400 au tétradécane, et on a ici un pic élué à peu près à mi-chemin.

On procède de la même façon pour tous nos pics, sur les deux colonnes. On peut aussi ignorer la colonne Aire, puisque dans le cas d’une huile essentielle, on utilise la convention « % de l’aire totale = % m/m de l’huile totale ». Pour simplifier l’exemple, voici, au tableau 2, les résultats pour les 5 plus grands pics sur chaque colonne capillaire.

Tableau 2. Temps de rétention, indice de rétention et pourcentage

des cinq pics les plus importants sur chaque colonne capillaire

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Reprenons le pic #29, sur DB-5. Il est temps de jeter un coup d’œil à notre banque de données, visible à la figure 2, pour voir quels composés pourraient correspondre à son IR de 1290. On conserve une petite marge (1288-1292) sachant que les RI peuvent être légèrement décalés d’analyse en analyse.

Figure 2. Extrait de notre banque de données, autour d'un IR de 1290.

Figure 2. Extrait de notre banque de données, autour d’un IR de 1290.

Notre banque de données est enrichie à chacune de nos analyses, ce qui nous permet d’y ajouter nos découvertes lorsque nous avons à utiliser un GC-MS. On voit qu’ici, plusieurs produits pourraient se qualifier pour correspondre au pic sur la colonne DB-5, qui constitue 9,4% de l’huile. En consultant le tableau 2, on remarque bien un pic représentant 9,36% de l’huile sur la colonne Solgel-Wax, avec un IR de 1627 sur cette seconde colonne. En revenant à notre banque de données, on ne peut que conclure que le pic est de l’acétate de trans-sabinyle, et non l’un des quatre autres candidats. Ce composé ayant déjà été rapporté dans le cerfeuil sauvage (1), la confiance dans notre identification est encore plus grande. Comme les pourcentages du total sur les deux colonnes sont très similaires, notre travail pour ce composé est terminé: il n’y a pas de coélution.

En revanche, on sait qu’une coélution se produit dans énormément d’huiles essentielles: celle du limonène et du β-phellandrène. Ces deux composés sont observés autour d’un IR de 1024 sur DB-5, et le pic principal de cette huile (le pic #15, avec 48,83% de l’huile) y correspond justement. En retournant au tableau 2, on voit que le pic #16 sur Solgel-Wax correspond à 46,02% de l’huile, avec un IR de 1188. Il s’agit donc du β-phellandrène, d’après nos banques. Toutefois, l’écart entre les pourcentages sur les deux colonne laisse croire que le limonène est aussi présent. En regardant dans la banque de données, on voit que le limonène est habituellement observé à un IR 1178 sur la colonne Solgel-Wax. De fait, un pic sur cette colonne, à 11,61 minutes (absent du tableau), possède exactement cet IR et vaut pour 1,45% de l’huile. Dans ce cas, l’utilisation de deux colonnes a donc permis d’identifier lequel des deux composés était le plus important, et d’attester de la présence du second.

En continuant le travail d’identification, on finit par compléter le tableau 3, pour les composés majoritaires de l’huile. Celui-ci commence à ressembler aux tableaux que vous trouverez dans nos rapports.

Tableau 3. Composition identifiée de l’huile de cerfeuil sauvage

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Davantage de travail nous permettrait d’identifier les composés minoritaires de l’huile, qui sont souvent tout aussi importants pour le contrôle de la qualité que les quelques composés majoritaires. En bout de piste, il nous restera quelques petits pics non identifiés, ce qui est tout à fait habituel. C’est ce pourquoi nous indiquons dans nos rapports le pourcentage total de l’huile ayant été caractérisé. Il nous faut en général quelques heures de travail pour caractériser entièrement un échantillon.

Bref, l’utilisation des IR sur deux colonnes nous permet d’analyser l’huile sans avoir systématiquement recours à un GC-MS, avec un excellent niveau de confiance dans l’identification. Si l’huile de cerfeuil sauvage est assez simple, les couples de IR sont en général tout aussi utiles pour des cas plus complexes, par exemple avec des huiles riches en sesquiterpènes ou en esters.

Référence

(1) Bos, R., Koulman, A., Woerdenbag, H., Quax, W. J., Pras, N. Volatile components from Anthriscus sylvestris (L.) Hoffm. J. Chromatogr. A 2002, 966, 233-238.

*La formule est adaptée par rapport aux livres de référence puisque nous n’utilisons que les alcanes à nombre pair de carbones:

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